Viz též: Lišta nástrojů pro měření
Pro kalibraci se užívají následující tlačítka nástrojové lišty:
1 - Set pixel size Provedení nové kalibrace.
2 - Save pixel size Uložení souboru s údaji o souřadnicovém umístění rastru a o velikosti pixelu.
Pro kalibraci je potřebný obraz, na němž je zobrazen liniový objekt známé délky. U mikroskopických snímků to zpravidla bývá objektivové měřítko. Může se jednat o tentýž obraz (rastrový soubor), na němž má být prováděno další měření, nebo o jiný obraz pořízený za stejných podmínek (minimálně stejný objektiv a shodné rozlišení fotoaparátu). Po zmáčknutí tlačítka Set pixel size zadáme lomové body nové linie (postup viz Odečet délek a ploch: Operace s liniemi). Většinou se jedná o pouhou úsečku, tedy o počáteční a koncový bod. V následujícím dialogovém okně zadáme skutečnou délku linie v reálných jednotkách
Dále vyplníme jméno standardu. Při zaškrtnutí políčka Save as calibration standard bude tento nový standard dostupný v programu FotoOverlay i pro použití s dalšími obrazy. Všechny kalibrační standardy jsou ukládány do souboru ImgPosition.dat umístěném v datovém adresáři programu (viz Typy používaných souborů).
Pokud je zvolen mód měření, musí být k aktuálnímu obrazu přiřazen kalibrační standard určující velikost pixelu. Tento standard je buď načten společně s rastrovými daty (ze souboru *.jgw, *.tfw nebo *.bpw) nebo jej uživatel vybere z uložených pojmenovaných standardů.
V průběhu měření lze stávající standard změnit pouze na základě kalibrace.
Pro další užití obrazu s daným standardem je možno aktuální standard uložit do souboru *.jgw, *.tfw nebo *.bpw) pomocí tlačítka Save pixel size. Tento nový soubor bude pojmenován podle jména aktuálně zobrazeného rastrového souboru.
Správa standardů a jejich přehled jsou dostupné v okně vyvolávaném příkazem menu Manage calibration standards (viz levý panel hlavního okna aplikace).
Zde je možné jednotlivé parametry stávajících kalibračních standardů přímo editovat. Další operace lze provádět pomocí tlačítek
Clear Zruší všechny stávající kalibrační standardy mimo prvního standardu Calibration.
Delete Zruší standard na aktuálně aktivním řádku.
Add Umožňuje manuální přidání kalibračního standardu, pro který je známa velikost obrazového pixelu.
Tlačítko 
slouží pro přepnutí
editačního módu tabulky do módu pro přesun celých řádků. Po zmáčknutí
tohoto tlačítka je možno měnit pořadí kalibračních standardů.
Tlačítkem OK zapíšeme provedené změny, tlačítkem Cancel opustíme okno bez zápisu přímo zapsaných změn.